線粒體疾病研究將開(kāi)啟一個(gè)新的時(shí)代。

當(dāng)?shù)貢r(shí)間7月8日，頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）在線發(fā)表了一項(xiàng)研究，題為“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”。來(lái)自美國(guó)麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)博德研究所化學(xué)生物學(xué)家劉如謙（David R. Liu）和華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)家Joseph Mougous領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)發(fā)了不依賴CRISPR系統(tǒng)的新型堿基編輯器（DdCBE），首次實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體基因組（mtDNA）的精準(zhǔn)編輯。

線粒體被稱為細(xì)胞的“能量工廠”，線粒體基因突變疾病通常由母系遺傳，損害了細(xì)胞產(chǎn)生能量的能力。與核基因組相比，線粒體基因組中的基因數(shù)量較少，但這些突變尤其會(huì)損害神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉，也包括心臟，對(duì)遺傳這些基因突變的人來(lái)說(shuō)可能是致命的。

然而，由于無(wú)法有效引導(dǎo)RNA進(jìn)入被膜包裹的線粒體內(nèi)等原因，“基因魔剪” CRISPR-Cas9對(duì)修飾線粒體DNA至今束手無(wú)策。

一種特殊的細(xì)菌毒素為這一研究領(lǐng)域帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)。2018年，Mougous團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種叫做DddA的酶，它是由伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia）產(chǎn)生的一種毒素，可以在DNA雙鏈上催化胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U）。值得一提的是，它可以直接作用于雙鏈DNA，而不需要Cas9酶來(lái)解旋。

實(shí)際上，細(xì)菌毒素代表了一個(gè)巨大的生物化學(xué)多樣性蓄水池，可以重新用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中的一些成員已在基因編輯技術(shù)中得到應(yīng)用。例如劉如謙之前開(kāi)發(fā)的單堿基編輯器即利用胞苷脫氨酶，但這種酶只作用于單鏈DNA，劉如謙必須依靠Cas9酶來(lái)破壞DNA，正因如此該技術(shù)也無(wú)法適用于線粒體基因組。

2018年底，劉如謙團(tuán)隊(duì)收到來(lái)自Mougous的郵件，隨后兩個(gè)團(tuán)隊(duì)達(dá)成合作。他們判斷，DddA適用于線粒體基因組。但是，要把DddA變成一種可行的基因組編輯工具，劉如謙等人還比如將其打磨。

修改雙鏈DNA的能力同時(shí)使得這種酶致命，它會(huì)讓每一個(gè)遇到的C位點(diǎn)發(fā)生突變。為防止這種情況發(fā)生，研究團(tuán)隊(duì)將酶分解成兩部分，只有當(dāng)它們?cè)诰庉嬑稽c(diǎn)結(jié)合在一起時(shí)，才能恢復(fù)活性改變DNA。此外，該基因編輯工具遞送到線粒體基質(zhì)必須要穿過(guò)線粒體的雙層膜，研究團(tuán)隊(duì)使用線粒體靶向信號(hào)（MTS）的氨基酸序列標(biāo)記了基因編輯工具，利用線粒體的蛋白質(zhì)吸收機(jī)制穿過(guò)線粒體的雙層膜。

同時(shí)需要注意的是，DddA作為一種胞苷脫氨酶，它能將胞嘧啶（C）脫氨變?yōu)槟蜞奏ぃ║），但U是RNA堿基，在DNA中易被尿嘧啶-DNA糖基化酶切掉，又恢復(fù)成C。研究團(tuán)隊(duì)最終利用尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）排除了這一干擾。這一步將編輯效率提高了近8倍。

總的來(lái)說(shuō)，研究設(shè)計(jì)了無(wú)毒且無(wú)活性的split-DddA半分子，DddA分裂半體與轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子陣列蛋白（TALE）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合，產(chǎn)生了無(wú)RNA的DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器（DdCBE），可催化人mtDNA中的C?G到T?A轉(zhuǎn)化，具有高靶標(biāo)特異性和產(chǎn)品純度。

該研究使用DdCBEs建模人類細(xì)胞中與疾病相關(guān)的mtDNA突變，結(jié)果顯示，不依賴CRISPR的DdCBE可以精確操縱mtDNA，催化人mtDNA中C?G到T?A的轉(zhuǎn)化的編輯效率在4.6%-49%之間。

邁阿密大學(xué)的線粒體遺傳學(xué)家Carlos Moraes評(píng)價(jià)道，“這是一個(gè)非常令人興奮的進(jìn)展，有了修改線粒體DNA的能力，我們就可以提出以前無(wú)法提出的問(wèn)題。”哥倫比亞大學(xué)線粒體疾病研究專家Michio Hirano甚至稱贊這一策略 “問(wèn)鼎了線粒體研究領(lǐng)域的圣杯”。

不過(guò)，劉如謙謹(jǐn)慎提醒說(shuō)，這項(xiàng)研究距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。他說(shuō)，盡管他的團(tuán)隊(duì)最初的研究顯示很少有脫靶現(xiàn)象，但還需要對(duì)不同的細(xì)胞類型進(jìn)行更多的研究，這畢竟是基因編輯技術(shù)的常見(jiàn)問(wèn)題。

劉如謙團(tuán)隊(duì)預(yù)計(jì)，這一最新的線粒體編輯工具可以修復(fù)49%已知的線粒體有害基因突變，將為線粒體遺傳病的研究、治療和預(yù)防帶來(lái)了前所未有的希望。

盡管醫(yī)學(xué)應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)，但英國(guó)劍橋大學(xué)線粒體遺傳學(xué)家Michal Minczuk表示，通過(guò)使用這項(xiàng)技術(shù)生成動(dòng)物模型，研究線粒體突變的影響，研究人員將在短期內(nèi)受益?！拔覀兛梢詷O大地加快這一進(jìn)程，這是一個(gè)驚人的進(jìn)步。”