2025年10月7日，瑞士伯爾尼大學(xué)Britta Engelhardt在Nature communications發(fā)表：In vivo imaging of the barrier properties of the glia limitans during health and neuroinflammation，揭示了健康和神經(jīng)炎癥期間膠質(zhì)界膜屏障特性的活體成像。

膠質(zhì)界膜包裹著整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）實(shí)質(zhì)的外表面以及血管周圍間隙，由一部分星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，這些星形膠質(zhì)細(xì)胞戰(zhàn)略性地位于這些實(shí)質(zhì)外周邊界處。目前對(duì)膠質(zhì)界膜在健康狀態(tài)和神經(jīng)炎癥期間的屏障特性仍了解不足。通過開發(fā)一種水通道蛋白-4（Aqp4）-mRuby3基因敲入報(bào)告小鼠可實(shí)現(xiàn)對(duì)表層和血管周圍膠質(zhì)界膜的活體成像，膠質(zhì)界膜對(duì)可溶性介質(zhì)、微珠和免疫細(xì)胞均構(gòu)成屏障。將Aqp4-mRuby3報(bào)告小鼠與針對(duì)血管、軟腦膜或髓系細(xì)胞的其他報(bào)告基因小鼠聯(lián)合使用能夠精確區(qū)分免疫細(xì)胞位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)邊界區(qū)域還是實(shí)質(zhì)內(nèi)部，從而明確其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫監(jiān)視與神經(jīng)病理過程中的功能作用。Aqp4-mRuby3報(bào)告小鼠的出現(xiàn)將有助于進(jìn)一步加深對(duì)膠質(zhì)界膜在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫豁免中所起主動(dòng)作用的理解。

圖一 Aqp4-mRuby3基因敲入報(bào)告小鼠的表征

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)界膜的活體可視化，作者利用了水通道蛋白4（AQP4）在形成膠質(zhì)界膜的血管周圍和軟膜下星形膠質(zhì)細(xì)胞中的極性表達(dá)特性。

研究人員構(gòu)建了Aqp4-mRuby3基因敲入小鼠，將紅色熒光蛋白mRuby3插入水通道蛋白AQP4的第二胞外環(huán)，使其在星形膠質(zhì)細(xì)胞表面正確表達(dá)并形成正交顆粒陣列（OAPs）。該融合蛋白定位于血管周圍終足和腦脊髓表面的膠質(zhì)界膜，與內(nèi)源性AQP4分布一致并靠近基底膜、血管內(nèi)皮和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。小鼠發(fā)育正常，遺傳穩(wěn)定且在血-視網(wǎng)膜屏障處也有表達(dá)。結(jié)果表明，AQP4-mRuby3能真實(shí)反映AQP4的生理定位，是研究星形膠質(zhì)細(xì)胞極性和膠質(zhì)-血管界面的可靠工具。

圖二 雜合子小鼠中AQP4-mRuby3的表達(dá)不影響神經(jīng)炎癥

研究發(fā)現(xiàn)，純合子Aqp4-mRuby3小鼠大腦含水量輕微但顯著增加，提示AQP4功能可能受影響；而雜合子小鼠腦和脊髓含水量正常，水分調(diào)節(jié)未受損。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，雜合子小鼠的臨床癥狀、免疫反應(yīng)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及疾病進(jìn)展與野生型小鼠無異且AQP4-mRuby3融合蛋白在炎癥區(qū)域同樣出現(xiàn)極性丟失，與內(nèi)源性AQP4變化一致。結(jié)果表明，雜合子Aqp4-mRuby3小鼠能正常表達(dá)融合蛋白，不影響生理水分平衡或神經(jīng)炎癥進(jìn)程，是研究AQP4動(dòng)態(tài)變化的可靠模型。

圖三 Aqp4-mRuby3基因敲入報(bào)告小鼠可用于膠質(zhì)界膜的活體成像

接下來，作者通過在右腦半球皮層表面放置的顱窗或磨薄顱骨制備以及在頸椎脊髓處開窗，利用雙光子活體顯微鏡對(duì)雜合子Aqp4-mRuby3報(bào)告小鼠進(jìn)行成像，以探索其用于大腦和脊髓膠質(zhì)界膜活體檢測(cè)的適用性。

結(jié)果：

在雙光子活體顯微鏡成像過程中，通過注射10 kDa的FITC-葡聚糖來顯示血管腔。使用1045 nm的激發(fā)波長(zhǎng)，可以在預(yù)期的腦部血管周圍和表層膠質(zhì)界膜位置檢測(cè)到AQP4-mRuby3信號(hào)。研究利用Aqp4-mRuby3雜合子小鼠結(jié)合雙光子活體顯微鏡和共聚焦成像，發(fā)現(xiàn)AQP4-mRuby3在血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足呈強(qiáng)極性表達(dá)，而在表層膠質(zhì)界膜則呈彌散分布。電鏡和共聚焦成像證實(shí)，表層膠質(zhì)界膜由星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起構(gòu)成，其AQP4-mRuby3極性分布于細(xì)胞外表面，且從表層到血管周圍呈連續(xù)過渡。雙光子成像中，二次諧波信號(hào)可清晰標(biāo)記膠原結(jié)構(gòu)，輔助定位。結(jié)果表明，Aqp4-mRuby3小鼠能真實(shí)反映AQP4的極性分布，適用于大腦和脊髓膠質(zhì)界膜的活體動(dòng)態(tài)成像研究。

圖四 在Aqp4-mRuby3小鼠中對(duì)膠質(zhì)界膜的可視化能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)區(qū)分CX3CR1-GFP+腦膜巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞

膠質(zhì)界膜有助于中樞神經(jīng)系統(tǒng)分區(qū)的形成，從而構(gòu)建出容納不同亞群中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐髓系細(xì)胞的區(qū)域。研究通過雜交Aqp4-mRuby3和CX3CR1-GFP小鼠，結(jié)合雙光子活體成像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同髓系細(xì)胞的精準(zhǔn)區(qū)分。利用AQP4-mRuby3標(biāo)記的膠質(zhì)界膜和膠原的二次諧波信號(hào)，可清晰定位硬腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔和血管周圍間隙中的邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞，以及實(shí)質(zhì)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞。

結(jié)果：

結(jié)果顯示，硬腦膜巨噬細(xì)胞呈圓形、靜止；邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞沿血管分布于膠質(zhì)界膜外側(cè)，形態(tài)偏阿米巴樣；小膠質(zhì)細(xì)胞位于實(shí)質(zhì)內(nèi)，突起動(dòng)態(tài)掃描并接觸膠質(zhì)界膜。在脊髓中，邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞豐富，而小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯少于大腦，與既往研究一致。該模型有效解決了傳統(tǒng)CX3CR1-GFP小鼠難以區(qū)分巨噬細(xì)胞亞群的問題，為研究腦-脊髓免疫微環(huán)境提供了高精度的活體成像工具。

該研究通過新型Aqp4-mRuby3報(bào)告小鼠，實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠質(zhì)界膜屏障的活體動(dòng)態(tài)成像，首次在活體水平清晰區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞與邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞，并揭示其在健康與神經(jīng)炎癥中的空間關(guān)系和結(jié)構(gòu)變化，為理解神經(jīng)免疫交互、屏障功能失調(diào)及開發(fā)靶向治療提供了關(guān)鍵工具和新視角。

閱讀原文