實(shí)驗(yàn)開始1周之前，進(jìn)行頭部固定手術(shù)，將用于頭部固定的金屬頭片與顱骨粘合。本實(shí)驗(yàn)中定制的金屬頭片是一個(gè)中間開口4mm×7mm的鈦合金平板，平板底面切割出貼合小鼠顱骨的弧面，方便兩者的粘連。手術(shù)過程如下：首先腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，用剪刀或脫毛膏去除小鼠顱頂毛發(fā)后，將動(dòng)物固定于立體定位儀上（注意不要破壞聽覺系統(tǒng)）。使用75%消毒酒精、碘酒清理皮膚表面，剪開皮膚后暴露顱骨，可適當(dāng)去除眼睛后緣到耳朵前緣范圍內(nèi)的皮膚，方便金屬頭片貼合顱骨。接下來，使用濃度為3%的雙氧水反復(fù)擦拭顱骨表面，氧化并用棉球擦除結(jié)締組織，保證顱骨表面干凈。在立體定位儀上調(diào)平顱面后，按照坐標(biāo)標(biāo)記目標(biāo)腦區(qū)（背側(cè)CA1：前囟后開2.2mm；中縫旁開1.6mm），方便后期實(shí)驗(yàn)操作。將金屬頭片放置與顱骨表面，來回滑動(dòng)立體定位儀針頭保證金屬頭片左右、前后水平，在金屬頭片與顱骨連接處滴入適量組織膠水，保證頭片與顱面充分粘合，并將皮膚邊緣粘合防止感染。待組織膠水凝固后，卸下小鼠，腹腔注射4萬單位青霉素，將其放置于溫箱保暖，待小鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠恢復(fù)。

電生理記錄前一天，將小鼠在實(shí)驗(yàn)臺上頭部固定，小鼠使用1.5%異氟烷吸入麻醉，使用牙科鉆配0.5mm鉆頭在定位位點(diǎn)輕打出直徑約0.8mm的記錄孔與位于右側(cè)前額葉的直徑0.5mm的參比孔，將記錄孔與參比孔蠟封保護(hù)。將小鼠放置于溫箱保暖，清醒后放回飼養(yǎng)籠。電生理記錄當(dāng)日，采集信號前，實(shí)驗(yàn)臺上將小鼠頭部固定，使用自制的鎢絲針在體式顯微鏡下清除骨膜與硬腦膜，使用生理鹽水保持記錄孔濕潤等待記錄。

行為學(xué)裝置

與頭部固定小鼠的痕跡型獎(jiǎng)賞性聯(lián)合學(xué)習(xí)配套的行為系統(tǒng)，主要包括頭部固定系統(tǒng)、行為控制系統(tǒng)與信號采集系統(tǒng)。頭部固定系統(tǒng)主要由轉(zhuǎn)盤與頭部固定支架構(gòu)成，頭部固定的小鼠可以在轉(zhuǎn)盤上跑動(dòng)，帶動(dòng)轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)。

行為控制系統(tǒng)由控制中心單片機(jī)操縱聲音裝置與給水裝置。聲音裝置為一套音響，放置于小鼠頭前兩側(cè)。給水裝置由微型電磁閥作為給水開關(guān)，給水管道系統(tǒng)靠重力實(shí)現(xiàn)給水，當(dāng)微型電磁閥接收到單片機(jī)命令打開時(shí)，出水針頭出水，每次出水水量可通過調(diào)整微型電磁閥打開時(shí)長控制。給水裝置配有以微型泵為核心的撤水系統(tǒng)，同樣由單片機(jī)控制，可以吸取出水針頭殘留水滴。

信號采集系統(tǒng)主要由紅外探頭構(gòu)成，紅外探頭放置于給水針頭的兩側(cè)，可以探測到小鼠的舔水動(dòng)作。紅外探頭檢測到的行為信號接入單片機(jī)，與單片機(jī)控制聲音信號、給水信號和吸水信號可通過計(jì)算機(jī)對行為信號實(shí)時(shí)展示與單獨(dú)記錄。這些信號也可由并行線路接入電生理記錄系統(tǒng)進(jìn)行行為學(xué)信號打標(biāo)。

行為學(xué)流程

痕跡型獎(jiǎng)賞性聯(lián)合學(xué)習(xí)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)過程共包括三個(gè)階段：習(xí)慣化（habituation）、條件化訓(xùn)練（conditioning）和檢測（testing）階段。

行為學(xué)流程示意圖

行為學(xué)流程包括4天（Day1-4）的習(xí)慣化、1天（Day5）的條件化訓(xùn)練與1天（Day6）的檢測，在習(xí)慣化前1天（Day0）將小鼠斷水。Water withdrawal：斷水；Habituation：習(xí)慣化；Conditioning：條件化訓(xùn)練；Testing：檢測。

習(xí)慣化階段持續(xù)四天（Day1-4），該階段包括小鼠對實(shí)驗(yàn)人員、頭部固定與行為裝置汲水的適應(yīng)。習(xí)慣化開始前一天（Day0）將小鼠斷水。習(xí)慣化期間，首先由實(shí)驗(yàn)人員撫觸（handling）小鼠15min，消除其緊張情緒小鼠出現(xiàn)洗臉行為（grooming）表明它處于放松狀態(tài)。接下來將小鼠頭部固定在實(shí)驗(yàn)臺上，高度適宜，使其適應(yīng)頭部固定狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)環(huán)境3-4h。適應(yīng)頭部固定后小鼠回籠休息0.5-1小時(shí)，再次將小鼠頭部固定并使其通過給水裝置汲水。給水裝置每間隔9-15s給水一次，一次出水約4μL，持續(xù)給水至小鼠不再舔水。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠與給水水頭的相對位置均保證小鼠無法直接通過胡須或嗅覺等方式感受到水，首次汲水時(shí)需實(shí)驗(yàn)人員引導(dǎo)。汲水結(jié)束后小鼠回籠，保持?jǐn)嗨c自由進(jìn)食。條件化訓(xùn)練當(dāng)天（Day5），小鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)人員撫觸后，不再進(jìn)行頭部固定狀態(tài)的適應(yīng)，保持體力。將小鼠頭部固定于實(shí)驗(yàn)臺后，直接開始條件化訓(xùn)練。訓(xùn)練過程中，CS與US配對出現(xiàn)，相鄰配對起始的間隔為9-15s。其中，CS為中性聲音刺激（8000Hz，75dB，100ms）；US為水獎(jiǎng)賞，給水后1.5s吸走；CS結(jié)束到US起始間隔1.2s。直到小鼠不再喝水，條件化訓(xùn)練結(jié)束。小鼠回籠，保持?jǐn)嗨c自由進(jìn)食。條件化訓(xùn)練次日（Day6）檢測小鼠對CS-US配對的記憶。小鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)人員撫觸后頭部固定，僅給與20次CS，CS起始間隔9-15s。

急性多通道記錄和信號采集

急性多通道記錄在小鼠條件化訓(xùn)練當(dāng)日（Day5）進(jìn)行。習(xí)慣化結(jié)束當(dāng)天（Day4）需進(jìn)行記錄開孔。多通道信號由RHD2000記錄系統(tǒng)采集，采樣頻率30kHz，儲存后用于線下分析。CS、US等行為學(xué)信號接入記錄系統(tǒng)一并采集儲存。兩個(gè)行為表現(xiàn)參數(shù)用于分析，條件反應(yīng)指數(shù)（conditioned response index，CRI）和相對條件反應(yīng)值（relative conditioned response index，rCRI）。前者用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體對應(yīng)數(shù)據(jù)的分析，后者用于跨個(gè)體數(shù)據(jù)分析。以聲音刺激前4s為錯(cuò)誤窗口（EW，error window），聲音刺激起始后1.3s（即CS時(shí)長與trace時(shí)長）為正確窗口（CW，correct window）統(tǒng)計(jì)舔水頻率，CR定義如下：CRI=RCW-REW。其中，RCW（ratein correct window）為正確窗口內(nèi)舔水頻率，REW（ratein error window）為錯(cuò)誤窗口內(nèi)舔水頻率。

相對條件化反應(yīng)指數(shù)

在條件化反應(yīng)指數(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行均一化。小鼠在某段行為中最優(yōu)表現(xiàn)為CS前不舔水，僅在CS后舔水，該段CRI可能的最大值即正確窗口舔水動(dòng)作頻率。因此，將每個(gè)block內(nèi)的rCRI均值定義如下：難度適中的獎(jiǎng)賞型聯(lián)合學(xué)習(xí)范式。小鼠能夠在適宜時(shí)長內(nèi)完成聯(lián)合型學(xué)習(xí)，既方便實(shí)驗(yàn)中單次、完整采集學(xué)習(xí)過程神經(jīng)元信號，也適于編碼過程的分析。

行為學(xué)范式

在該范式中，頭部固定的小鼠放置于由腳部轉(zhuǎn)盤、嘴前水頭和頭朝向兩側(cè)的喇叭構(gòu)成的行為學(xué)裝置中，進(jìn)行聲音和水配對的聯(lián)合型學(xué)習(xí)。小鼠聯(lián)合學(xué)習(xí)訓(xùn)練前，首先經(jīng)歷4天撫觸和頭部固定的自由汲水以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員以及實(shí)驗(yàn)裝置。在第5天小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，學(xué)習(xí)聲音與水獎(jiǎng)賞的配對，聲音（8000Hz，75dB，100ms）為條件刺激（CS，conditioned stimulus），水為獎(jiǎng)賞性非條件刺激（US，unconditioned  stimulus），CS結(jié)束到US起始之間為痕跡間隔（trace），時(shí)長1.2s。一次CS-US配對為一次試驗(yàn)（trial），大多數(shù)小鼠可在200至300個(gè)trial中展示良好的行為學(xué)表現(xiàn)。訓(xùn)練次日，僅給與小鼠聲音刺激而不給水，觀察小鼠對CS的反應(yīng)來檢測小鼠對前日聲音-水獎(jiǎng)賞聯(lián)合學(xué)習(xí)的記憶。假手術(shù)學(xué)習(xí)組行為學(xué)流程與學(xué)習(xí)組類似，僅在第5天小鼠進(jìn)行訓(xùn)練時(shí)將CS與US順序調(diào)換。

行為學(xué)裝置示意圖與學(xué)習(xí)組對應(yīng)階段行為學(xué)方案

A.裝置適應(yīng)期（第1-4天），水頭僅給與水，給水間隔9-15s內(nèi)隨機(jī)；

B條件訓(xùn)練日（第5天），聲音-水配對，間隔1.2s，給水窗口結(jié)束時(shí)水頭吸水，相鄰配對間隔9-15s內(nèi)隨機(jī)，并伴隨有相應(yīng)電生理實(shí)驗(yàn)的記錄；

C檢測日（第6天），僅給與聲音刺激，水頭不給水，聲音間隔9-15s內(nèi)隨機(jī)。水管上箭頭：給水與吸水；CS：條件刺激；US：非條件刺激。

行為學(xué)表現(xiàn)的衡量

隨著trial數(shù)的增加，小鼠舔水動(dòng)作分布（lick）逐漸集中于CS后與給水區(qū)間，表明小鼠逐漸掌握聲音-水獎(jiǎng)賞的聯(lián)合。學(xué)習(xí)全程舔水動(dòng)作的分布圖顯示CS后小鼠舔水頻率驟然上升。次日，僅給CS的檢測中，小鼠舔水動(dòng)作集中于CS后，表現(xiàn)出對聲音-水獎(jiǎng)賞聯(lián)合的記憶。而假學(xué)習(xí)組小鼠在訓(xùn)練過程中和次日的檢測中均未表現(xiàn)出對聲音后舔水的偏好。

學(xué)習(xí)組與假學(xué)習(xí)組小鼠學(xué)習(xí)過程與檢測展示

A學(xué)習(xí)組為小鼠訓(xùn)練過程中舔水圖（上），每個(gè)點(diǎn)表示一次舔水；整體舔水分布圖（下），組距為0.2s；

B假學(xué)習(xí)組為小鼠訓(xùn)練過程中舔水圖（上），每個(gè)點(diǎn)表示一次舔水；整體舔水分布圖（下），組距為0.2s；

C（A）中學(xué)習(xí)小鼠次日僅給予聲音刺激檢測結(jié)果；

D（B）中假學(xué)習(xí)小鼠次日僅給予聲音刺激檢測結(jié)果。黑色背景條標(biāo)記聲音刺激，藍(lán)色背景條標(biāo)記給水區(qū)間。

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