現(xiàn)代感覺神經(jīng)生理學(xué)已經(jīng)轉(zhuǎn)向使用清醒動物，以避免麻醉劑對神經(jīng)反應(yīng)特性的影響，這些影響在丘腦和皮層階段比以前認(rèn)為的要大得多。然而，這種實(shí)驗(yàn)實(shí)踐的轉(zhuǎn)變主要集中在包括皮層cortex、丘腦thalamus和上丘colliculus在內(nèi)的高級處理階段，而對于位于腦干深處的早期感覺區(qū)域，現(xiàn)有的大部分認(rèn)知仍然依賴于在麻醉下進(jìn)行的記錄。近年來，細(xì)胞外記錄甚至成像技術(shù)的進(jìn)步使得在清醒條件下訪問腦干成為可能，包括在耳蝸核（聽覺系統(tǒng)的第一個中繼站）中的開創(chuàng)性記錄。這些研究表明，清醒狀態(tài)下早期聽覺系統(tǒng)的聲音調(diào)諧特性與麻醉狀態(tài)下觀察到的相似，盡管在麻醉狀態(tài)下自發(fā)活動明顯減少，反應(yīng)閾值略有增加，這與去腦和癱瘓貓的早期觀察一致。然而，這些結(jié)論并不是基于同一神經(jīng)元在不同狀態(tài)下的聲音表征的直接比較，這對于確定麻醉狀態(tài)下感覺編碼是否一對一保留是必要的。聽覺神經(jīng)生理學(xué)中最常用的全身麻醉劑是吸入麻醉劑（主要是異氟烷）和與鎮(zhèn)靜劑（賽拉嗪或美托咪定）結(jié)合使用的氯胺酮。吸入麻醉劑和鎮(zhèn)靜劑通過作用于GABA（γ-氨基丁酸, γ-aminobutyric acid）受體強(qiáng)烈增強(qiáng)抑制電流，而氯胺酮則阻斷N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-d-aspartate, NMDA）電流。在網(wǎng)絡(luò)規(guī)模上應(yīng)用時，這可能導(dǎo)致興奮-抑制平衡的大幅度變化，從而導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)動態(tài)和刺激驅(qū)動反應(yīng)的深刻變化。然而，麻醉對早期感覺網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)大網(wǎng)絡(luò)規(guī)模效應(yīng)的存在研究甚少。

巴黎西岱大學(xué)和巴斯德研究所的Brice Bathellier團(tuán)隊(duì)在Science Advanves上發(fā)表文章Massive perturbation of sound representations by anesthesia in the auditory brainstem，通過在小鼠的耳蝸核中使用線性多電極陣列（Neuropixels 1.0）進(jìn)行細(xì)胞外記錄，其涵蓋清醒和異氟烷麻醉狀態(tài)下的大范圍聲音，進(jìn)而廣泛地探測兩種狀態(tài)下的聲音表征結(jié)構(gòu)。研究團(tuán)隊(duì)觀察到麻醉狀態(tài)下尖峰統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)生了顯著變化，自發(fā)放電率大幅降低，揭示了麻醉對單個神經(jīng)元功能特性的修改遠(yuǎn)超之前描述的效果，許多在清醒狀態(tài)下反應(yīng)微弱或無反應(yīng)的神經(jīng)元在麻醉狀態(tài)下變得對聲音高度敏感，反之亦然；這些變化修改了群體水平的神經(jīng)編碼，可能導(dǎo)致在麻醉狀態(tài)下聽覺皮層下游觀察到的聲音相關(guān)信息減少。

圖源 Science Advances

首先，為了能在清醒的小鼠中訪問耳蝸核，研究人員訓(xùn)練小鼠在頭部固定的情況下保持安靜，并依賴于此，研究人員得以將Neuropixels 1.0探針以預(yù)定的角度和進(jìn)入點(diǎn)插入小鼠頭部。通過反復(fù)穿刺直到檢測到與聲音同步的反應(yīng)來微調(diào)探針定位，記錄可以連續(xù)進(jìn)行3天，在4只小鼠中共獲得了7次記錄。在最后一次記錄后，通過熒光染料標(biāo)記的電極軌跡進(jìn)行組織學(xué)鑒定確定探針的確切位置，其中5次記錄針對后腹耳蝸核（postero-ventral cochlear nucleus, PVCN），2次針對背耳蝸核（dorsal cochlear nucleus, DCN）。在小鼠清醒狀態(tài)下（80分鐘）和1.1%異氟烷麻醉狀態(tài)下記錄耳蝸核的活動。通過觀察原始電壓波形，可以清楚地看到清醒和麻醉狀態(tài)下腦活動模式的變化，而在麻醉狀態(tài)下高頻波動的幅度顯著下降。通過計(jì)算高頻波動的中位絕對偏差量化這一變化，麻醉狀態(tài)下高頻波動減少了2到4倍。高頻波動的幅度主要對應(yīng)于細(xì)胞外動作電位的總和，通常與局部群體放電率呈亞線性關(guān)系。因此，可以估計(jì)清醒和麻醉狀態(tài)下群體放電率減少了三倍以上，這與之前使用不同麻醉協(xié)議的報告一致。

圖1 清醒和麻醉狀態(tài)下小鼠耳蝸核神經(jīng)元的電生理記錄

這種活動模式的巨大變化對提取單一神經(jīng)元活動的尖峰分類性能產(chǎn)生了強(qiáng)烈影響。研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用Kilosort 2.5對清醒和麻醉數(shù)據(jù)集進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)麻醉狀態(tài)下檢測到的尖峰顯著減少。然而，數(shù)據(jù)的視覺檢查顯示，許多明顯的尖峰波形在麻醉期間未被分配到任何簇。研究團(tuán)隊(duì)調(diào)整了兩種方法來優(yōu)化不同狀態(tài)下的神經(jīng)元跟蹤。首先，分別對每種狀態(tài)進(jìn)行尖峰分類，然后根據(jù)波形相似性匹配檢測到的單元，此方法在麻醉和清醒狀態(tài)下分別檢測到173和163個單元，但只有18個單元在兩種狀態(tài)下匹配。其次，通過在麻醉數(shù)據(jù)上定義初始模板并在整個會話中應(yīng)用寬松參數(shù)，直接跟蹤兩種狀態(tài)下的神經(jīng)元，此方法在兩種狀態(tài)下跟蹤了163個單元。盡管尖峰分類存在困難，研究團(tuán)隊(duì)成功地跟蹤了相同單元的活動，生成了兩個數(shù)據(jù)集：一個具有高可靠性但跨狀態(tài)跟蹤的單元較少，另一個具有更多但可靠性較低的單元。

圖2 麻醉帶來的廣泛活動變化會影響尖峰排序

為了驗(yàn)證這兩個尖峰分類數(shù)據(jù)集，研究團(tuán)隊(duì)將清醒和麻醉狀態(tài)作為兩個獨(dú)立的數(shù)據(jù)集，確認(rèn)了異氟烷麻醉對耳蝸核的影響。多項(xiàng)研究表明，麻醉狀態(tài)下自發(fā)放電率顯著下降，導(dǎo)致清醒狀態(tài)下明顯的負(fù)反應(yīng)消失。這些研究還報告了純音反應(yīng)的調(diào)諧寬度變窄和強(qiáng)度閾值升高。研究數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)沒有聲音呈現(xiàn)時，自發(fā)活動的顯著減少在光柵圖中清晰可見。通過計(jì)算每個單元在所有約2秒間隔內(nèi)的自發(fā)放電率，可以發(fā)現(xiàn)麻醉狀態(tài)下的放電率分布向低放電率偏移，且清醒狀態(tài)下69%（split s.s.）和51%（consensus s.s.）的單元自發(fā)放電率超過1 Hz，而麻醉狀態(tài)下僅為20%和16%。相比之下，清醒狀態(tài)下只有1%和2%的單元沒有自發(fā)尖峰，而麻醉狀態(tài)下分別為47%和32%。這些觀察結(jié)果與之前的報告一致，即麻醉狀態(tài)下，自發(fā)活動減少導(dǎo)致聲音驅(qū)動的放電率降低消失，并且盡管自發(fā)網(wǎng)絡(luò)動態(tài)發(fā)生了巨大變化，異氟烷麻醉下對聲音的正反應(yīng)仍然清晰可見。研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，麻醉略微減少了對高頻率的調(diào)諧，但這種減少并不顯著。調(diào)諧曲線的半寬度顯示，清醒狀態(tài)下的調(diào)諧略寬于麻醉狀態(tài)。這一效應(yīng)在低強(qiáng)度下更明顯，表明麻醉下調(diào)諧寬度的減少可能與聲音強(qiáng)度閾值增加有關(guān)。

圖3 麻醉劑能降低神經(jīng)元自發(fā)放電和聲音誘發(fā)的抑制反應(yīng)

圖4 麻醉會使頻率調(diào)諧變得更加敏銳，并提高強(qiáng)度閾值

研究團(tuán)隊(duì)對比了麻醉對自發(fā)活動和聲音反應(yīng)的不同影響，進(jìn)一步探討了兩種狀態(tài)下的聲音表征，通過繪制單細(xì)胞調(diào)諧曲線，發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞水平的響應(yīng)變化比平均群體特性更顯著。一些神經(jīng)元僅在一種狀態(tài)下有反應(yīng)：清醒狀態(tài)下對純音調(diào)諧明顯的神經(jīng)元在麻醉狀態(tài)下幾乎沒有反應(yīng)，反之亦然；還有一些神經(jīng)元在清醒狀態(tài)下被聲音抑制，而在麻醉狀態(tài)下被激發(fā)。麻醉狀態(tài)下自發(fā)活動減少，導(dǎo)致抑制性反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量極少。盡管如此，某些神經(jīng)元在兩種狀態(tài)下的響應(yīng)變化較小?；贛ann-Whitney U檢驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在split s.s.和consensus s.s.數(shù)據(jù)集中，分別有18/18和129/163個神經(jīng)元在最佳頻率（BF）下有顯著響應(yīng)。麻醉狀態(tài)下，24/129個神經(jīng)元在BF下的放電顯著減少，34/129個顯著增加，35/129個響應(yīng)符號顯著變化，36/129個在兩種狀態(tài)下沒有顯著變化。麻醉狀態(tài)下響應(yīng)較大的神經(jīng)元并非由于清醒狀態(tài)下漏檢的尖峰。研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，麻醉主要影響神經(jīng)元是否參與表征，而非其代表的頻率。為了驗(yàn)證這一結(jié)果是否適用于其他麻醉劑，研究團(tuán)隊(duì)使用氯胺酮-美托咪定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)清醒狀態(tài)下自發(fā)活動顯著增加，盡管不如異氟烷顯著，這表明這種效應(yīng)并不局限于異氟烷。

圖5 在不同狀態(tài)下追蹤神經(jīng)元對聲音反應(yīng)的大量調(diào)節(jié)

圖6 異氟醚麻醉會改變聲音信息在耳蝸核神經(jīng)元中的分布方式

在該研究中，研究人員設(shè)計(jì)了一個聲音刺激實(shí)驗(yàn)，即在清醒和異氟烷麻醉狀態(tài)下，向小鼠呈現(xiàn)一系列聲音刺激，包括純音、調(diào)幅或調(diào)頻聲音以及復(fù)雜聲音，記錄耳蝸核的神經(jīng)活動。具體而言，研究團(tuán)隊(duì)首先使用Python生成聲音，并通過Matlab以192 kHz的頻率傳輸，將聲音傳輸?shù)椒胖迷谛∈笄胺?0至15厘米處的放大自由場揚(yáng)聲器，且聲音強(qiáng)度在開始和結(jié)束時以10毫秒的余弦斜坡方式（cosine ramped）變化，以避免頻譜擴(kuò)散。將頭部固定的小鼠使用隔音箱隔離，以減少外部噪音。研究團(tuán)隊(duì)向小鼠呈現(xiàn)了兩組聲音。第一組包括307個短聲音（500毫秒），每個聲音重復(fù)12次，隨機(jī)順序播放，聲音間隔1秒。聲音包括28個純音、26個線性強(qiáng)度變化的聲音、48個和弦、20個頻率掃頻、30個帶通白噪聲、48個調(diào)幅聲音、60個復(fù)雜聲音和47個分解聲音。第二組包括10個自然聲音樣本，每個樣本播放兩次，間隔在短聲音塊之間。首先在清醒狀態(tài)下（80分鐘）呈現(xiàn)聲音，然后通過鼻罩快速誘導(dǎo)2%異氟烷麻醉，隨后將濃度降低到1.1%。整個過程中通過紅外視頻監(jiān)控麻醉的連續(xù)性。麻醉狀態(tài)下再次呈現(xiàn)聲音集，然后移除鼻罩讓小鼠醒來。研究人員將收集到的數(shù)據(jù)通過尖峰分類算法（Kilosort 2.5）對清醒和麻醉狀態(tài)下的神經(jīng)元活動進(jìn)行分類和比較，分析麻醉對神經(jīng)元響應(yīng)特性的影響。

該研究指出，麻醉對耳蝸核神經(jīng)元的自發(fā)活動和聲音響應(yīng)有顯著影響，麻醉狀態(tài)下自發(fā)放電率顯著降低，導(dǎo)致聲音驅(qū)動的負(fù)反應(yīng)消失，但對聲音的正反應(yīng)仍然存在。麻醉還會改變神經(jīng)元的功能特性，使得一些在清醒狀態(tài)下無反應(yīng)的神經(jīng)元在麻醉狀態(tài)下變得高度敏感，反之亦然。未來的研究可以深入探討不同麻醉劑對聽覺系統(tǒng)的影響，并研究這些變化對聽覺信息處理的長期影響。該研究將有助于更好地理解麻醉對神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛影響，并改進(jìn)神經(jīng)科學(xué)研究中的實(shí)驗(yàn)方法。

原文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado2291#sec-4

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