癌癥組織中常見(jiàn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，其與腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等共同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境（TME）。三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）是免疫細(xì)胞在炎癥、感染或腫瘤組織中形成的有序異位區(qū)域結(jié)構(gòu)。以往研究發(fā)現(xiàn)了構(gòu)成腫瘤TLS的主要細(xì)胞種類(lèi)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞（APCs）、支持性的間質(zhì)細(xì)胞和濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞（FDC）。近期，利用單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在卵巢癌、頭頸鱗癌、腎癌等研究進(jìn)一步揭示了TLS中存在包括CXCL13+ T輔助細(xì)胞、SEMA4A+生發(fā)中心B細(xì)胞和CXCL12+成纖維細(xì)胞等關(guān)鍵細(xì)胞亞群。這些結(jié)果說(shuō)明TLS組成復(fù)雜并存在廣泛的異質(zhì)性。已有研究證實(shí)，TLS及其組分在抑制腫瘤進(jìn)展和促進(jìn)免疫治療反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但TLS如何形成及其發(fā)揮作用機(jī)制尚未清楚。

2024年9月4日，廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)會(huì)單細(xì)胞科技分會(huì)主任委員、中山大學(xué)腫瘤防治中心貝錦新教授及其團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表了題為《Single-Cell and Spatial Transcriptome Analyses Reveal Tertiary Lymphoid Structures Linked to Tumour Progression and Immunotherapy Response in Nasopharyngeal Carcinoma》的研究論文。該研究以鼻咽癌（NPC）為模型，首次系統(tǒng)解析了單細(xì)胞和空間水平上腫瘤內(nèi)TLS的細(xì)胞組成及抗腫瘤作用機(jī)制，為腫瘤患者免疫治療提供了新的靶點(diǎn)，為預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療療效提供有效工具。

NPC腫瘤微環(huán)境以EB病毒（EBV）感染腫瘤細(xì)胞和大量免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)為主要特點(diǎn)。該團(tuán)隊(duì)針對(duì)NPC不同分期、免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療響應(yīng)差異等臨床現(xiàn)象，利用10x Genomics 5' 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、免疫組庫(kù)（VDJ）測(cè)序以及Stereo-seq和Visium空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)，解析NPC腫瘤組織內(nèi)TLS的細(xì)胞組成，詳細(xì)刻畫(huà)了腫瘤進(jìn)展、免疫治療響應(yīng)相關(guān)的腫瘤TLS組成變化，解析了其抗腫瘤作用機(jī)制，并且通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、生存分析、多重免疫組化和相關(guān)公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集等方法驗(yàn)證了重要的發(fā)現(xiàn)（圖1）。

圖1. 整體研究設(shè)計(jì)

研究人員首先利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定了NPC腫瘤組織中五個(gè)具有典型TLS標(biāo)記物的細(xì)胞亞群，包括生發(fā)中心（GC）B細(xì)胞（CD19, MS4A1, RGS13, AICDA, BCL6；明區(qū)和暗區(qū)）、CD4+CXCR5+ T濾泡輔助細(xì)胞（CD4, CXCR5, CXCL13, BCL6）、CXCL13+CD8+ T細(xì)胞（CD8A, CXCR5, CXCL13, BCL6）以及CXCL13+腫瘤相關(guān)成纖維（CAFs）細(xì)胞（COL1A1, CXCL13, CCL19, CCL21），進(jìn)一步利用Stereo-seq和Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證了上述細(xì)胞亞群空間位于TLS內(nèi)。

針對(duì)TLS中GC B細(xì)胞的關(guān)鍵角色，研究人員通過(guò)擬時(shí)序分化軌跡分析揭示了幼稚B細(xì)胞向記憶B細(xì)胞、GC B細(xì)胞和漿細(xì)胞的分化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，生發(fā)中心反應(yīng)所生成的漿細(xì)胞可能是抗腫瘤抗體的重要來(lái)源。然而，通過(guò)一系列生物信息學(xué)分析，研究人員觀察到，相較于早期NPC，在晚期NPC中GC B細(xì)胞與漿細(xì)胞之間的相同BCR克隆型轉(zhuǎn)換減少，漿細(xì)胞所產(chǎn)生的IgA和IgG抗體水平顯著較低；并且，低GC B細(xì)胞比例和抗體水平與患者不良預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果表明，隨著腫瘤進(jìn)展，經(jīng)歷生發(fā)中心反應(yīng)的漿細(xì)胞抗體產(chǎn)生減少，進(jìn)而不利于NPC患者的預(yù)后。進(jìn)一步研究表明，NPC中的漿細(xì)胞與NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞緊密共定位，可能通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC；NK細(xì)胞）和抗體依賴性細(xì)胞吞噬（ADCP；巨噬細(xì)胞）作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，NPC內(nèi)漿細(xì)胞的數(shù)量與高表達(dá)EBV相關(guān)分子的惡性細(xì)胞亞群（具有更強(qiáng)免疫抑制功能）呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)定量分析空間轉(zhuǎn)錄組和多重免疫組化數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞分泌的抗體通過(guò)ADCC和ADCP機(jī)制促進(jìn)了高表達(dá)EBV相關(guān)分子惡性細(xì)胞的凋亡。這一過(guò)程對(duì)解除NPC的免疫抑制微環(huán)境以及改善NPC患者對(duì)免疫治療的響應(yīng)具有重要意義。此外，研究還定義了腫瘤細(xì)胞聚集區(qū)域（TCA），根據(jù)其中EBV相關(guān)分子和漿細(xì)胞分布，能夠?qū)PC腫瘤分為四類(lèi)，發(fā)現(xiàn)TCA表達(dá)高水平EBV相關(guān)分子和具有較多漿細(xì)胞浸潤(rùn)的亞型（EBVhigh-TCA-wP）預(yù)后最好（圖2）。

該研究發(fā)現(xiàn)TLS相關(guān)CXCL13+CAFs通過(guò)CXCL13-CXCR5、VCAM1-整合素、ICAM1-整合素等配體-受體對(duì)與B細(xì)胞進(jìn)行相互作用，并通過(guò)ST分析、多重免疫組化分析及體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CXCL13+CAFs促進(jìn)B細(xì)胞趨化、粘附以及分化和成熟。這些發(fā)現(xiàn)表明CXCL13+CAFs在促進(jìn)NPC患者免疫應(yīng)答和改善預(yù)后中扮演了重要角色。

研究者還發(fā)現(xiàn)TLS相關(guān)的CXCL13+CD8+ T細(xì)胞在識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CXCL13+CD8+ T細(xì)胞在早期腫瘤中的比例顯著高于晚期腫瘤，凸顯了它們?cè)谀[瘤早期階段發(fā)揮抗腫瘤潛力。這些發(fā)現(xiàn)表明在晚期腫瘤中增加CXCL13+CD8+ T細(xì)胞含量可能有助于提高抗腫瘤治療效果，為治療晚期腫瘤提了供新的策略。

最后，在NPC中與腫瘤TLS相關(guān)的細(xì)胞亞群通過(guò)配體-受體相互作用形成了一個(gè)免疫活化微環(huán)境，這與患者的預(yù)后密切相關(guān)。生存分析顯示，具有高TLS細(xì)胞標(biāo)志（TLS-CS）的患者比低TLS-CS的患者呈現(xiàn)顯著更好的預(yù)后。此外，多重免疫組化染色驗(yàn)證了含有TLS的樣本中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度更高，與患者更好的預(yù)后關(guān)聯(lián)，強(qiáng)調(diào)了TLS作為預(yù)后指標(biāo)的獨(dú)立作用。這些研究結(jié)果表明，TLS中的關(guān)鍵細(xì)胞亞群不僅在NPC的腫瘤微環(huán)境中創(chuàng)建了一個(gè)免疫活化的區(qū)域，而且顯著影響患者的預(yù)后和對(duì)免疫治療的響應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)再次強(qiáng)調(diào)了維持或增強(qiáng)這種免疫微環(huán)境的潛在治療價(jià)值。

總之，該研究首次利用高發(fā)于我國(guó)的EBV感染相關(guān)鼻咽癌，在單細(xì)胞和空間水平高分辨率上解析了腫瘤TLS細(xì)胞組成異質(zhì)性，鑒定了構(gòu)成TLS結(jié)構(gòu)的重要細(xì)胞亞群及分子特征，闡明了TLS抑制腫瘤進(jìn)展和促進(jìn)免疫治療反應(yīng)的機(jī)制（圖2），為基于TLS的腫瘤分子分型和免疫治療提供了新的策略。

圖2. 鼻咽癌免疫治療響應(yīng)及非響應(yīng)患者腫瘤組織細(xì)胞組分示意圖

中山大學(xué)腫瘤防治中心劉洋博士、何帥副研究員、遲冬梅主治醫(yī)生和王秀芝博士后、中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院葉雙燕博士為本文的共同第一作者，中山大學(xué)腫瘤防治中心貝錦新教授為通訊作者。相關(guān)研究成果已申請(qǐng)專(zhuān)利，將進(jìn)一步推動(dòng)成果臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，保障人民健康。

該研究獲得國(guó)家自然科學(xué)基金與澳門(mén)科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金（FDCT-NSFC；82261160657）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（NKRDPC；2022YFC3400901）、國(guó)家自然科學(xué)基金（82130078）、廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目基金（201707020039）、廣東省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（2016ZT06S638）等資助。

貝錦新課題組主要從事精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，圍繞腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的核心理念，利用個(gè)體和單細(xì)胞水平的基因組、表達(dá)譜等多層次、多組學(xué)信息，挖掘與腫瘤發(fā)生發(fā)展及其異質(zhì)性相關(guān)的分子、細(xì)胞及其作用網(wǎng)絡(luò)，研究候選分子、細(xì)胞調(diào)控腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與腫瘤早期精準(zhǔn)診斷相關(guān)的分子標(biāo)志物，篩選針對(duì)腫瘤微環(huán)境演進(jìn)關(guān)鍵事件的精準(zhǔn)診治靶標(biāo)，為實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化防診治提供有效解決方案。至今發(fā)表SCI論文100余篇，其中包括國(guó)際頂級(jí)專(zhuān)業(yè)雜志Cell、Lancet Oncology、Nature Genetics、Advanced Science、Genome Biology、Nature Communications等。團(tuán)隊(duì)擁有高通量測(cè)序及基因分型、單細(xì)胞組學(xué)平臺(tái)（10X Genomics聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室）、高性能計(jì)算集群等平臺(tái)，所在依托單位擁有先進(jìn)的動(dòng)物、細(xì)胞、分子水平相關(guān)研究平臺(tái)。課題組經(jīng)費(fèi)充足、科研氛圍濃厚、團(tuán)隊(duì)成員關(guān)系融洽。課題組長(zhǎng)期招聘各類(lèi)科研人員，歡迎對(duì)相關(guān)領(lǐng)域感興趣的博士后，博士生加入。

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