嗎啡是一種廣泛使用的有效鎮(zhèn)痛藥，可以緩解嚴(yán)重的急性和慢性疼痛。然而，由于成癮性濫用的泛濫，嗎啡已受到了嚴(yán)格的審查。盡管嗎啡作用于多個(gè)中樞和外周的疼痛通路，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制的神經(jīng)解剖基礎(chǔ)并未完全闡明。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腦干的腹內(nèi)側(cè)延髓（rostral ventromedial medulla, RVM）是影響疼痛體驗(yàn)的復(fù)雜大腦網(wǎng)絡(luò)的最終共同輸出節(jié)點(diǎn)。RVM損傷可以消除嗎啡鎮(zhèn)痛作用，而電刺激RVM則可以產(chǎn)生強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛效果。這些鎮(zhèn)痛效果依賴(lài)于從RVM投射到脊髓的軸突束，激活從RVM投射到脊髓背角（dorsal horn）的神經(jīng)元進(jìn)而引起機(jī)械性鎮(zhèn)痛，影響疼痛信息的加工，從而調(diào)節(jié)了逃避反射的增強(qiáng)或抑制。這些脊髓投射神經(jīng)元還控制上行傳遞的加工，從而影響疼痛的情感和感知維度。

摘要圖 鑒定調(diào)節(jié)嗎啡抗傷害感受的神經(jīng)元

根據(jù)RVM電刺激的強(qiáng)度，疼痛感受可以被增強(qiáng)或抑制。RVM中的5-羥色胺能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元，甚至可能還有谷氨酸能神經(jīng)元都參與了疼痛的調(diào)節(jié)。疼痛刺激與某些RVM神經(jīng)元活動(dòng)的增強(qiáng)或降低相關(guān)。嗎啡鎮(zhèn)痛所依賴(lài)的μ型阿片受體廣泛存在于參與疼痛體驗(yàn)的所有神經(jīng)底物中，實(shí)驗(yàn)證據(jù)也支持脊髓和多個(gè)腦區(qū)在鎮(zhèn)痛中的參與。因此，RVM下行抑制對(duì)上行傳遞的相對(duì)貢獻(xiàn)以及其中涉及的機(jī)制，一直是理解阿片類(lèi)藥物鎮(zhèn)痛作用的一個(gè)重要問(wèn)題。

8月30日，卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院的Patrik Ernfors團(tuán)隊(duì)在Science雜志上發(fā)表論文Morphine-responsive neurons that regulate mechanical antinociception，探究嗎啡誘導(dǎo)的機(jī)械性止痛在小鼠中的神經(jīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了一組特定的神經(jīng)元集群在RVM中對(duì)嗎啡有反應(yīng)，并在調(diào)節(jié)機(jī)械性疼痛敏感性中起關(guān)鍵作用。

圖源：Science

圖1 RVM中的嗎啡抗疼痛集合體

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一組位于RVM中的神經(jīng)元RVMBDNF，它們?cè)谡{(diào)節(jié)機(jī)械性疼痛方面起著關(guān)鍵作用，并且對(duì)嗎啡刺激具有反應(yīng)。這些神經(jīng)元屬于一個(gè)特定的神經(jīng)回路（RVM-脊髓回路），該回路可以調(diào)節(jié)機(jī)械性疼痛的感知，并賦予嗎啡其鎮(zhèn)痛特性。通過(guò)強(qiáng)制激活或抑制這些RVMBDNF神經(jīng)元，研究人員可以模擬嗎啡誘導(dǎo)的機(jī)械性鎮(zhèn)痛效果，而抑制它們則可以完全逆轉(zhuǎn)嗎啡誘導(dǎo)的機(jī)械性鎮(zhèn)痛，這一過(guò)程依賴(lài)于BDNF/TrkB信號(hào)通路，并且是通過(guò)激活脊髓上的抑制性神經(jīng)元（galanin-positive neurons）來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究人員通過(guò)，發(fā)現(xiàn)激活RVM中的嗎啡反應(yīng)性神經(jīng)元可以增加脊髓背角淺層的神經(jīng)元活性，而抑制這些脊髓神經(jīng)元?jiǎng)t可以完全消除RVM神經(jīng)元激活或嗎啡導(dǎo)致的機(jī)械性鎮(zhèn)痛效果。

圖2 嗎啡抗疼痛效應(yīng)相關(guān)的RVM神經(jīng)元群體的分子特征

在進(jìn)一步的驗(yàn)證中，研究人員結(jié)合TRAP和CANE（capturing activated neuronal ensembles）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)激活RVM中的谷氨酸能神經(jīng)元可以增加脊髓背角淺層神經(jīng)元的活性，而這些脊髓神經(jīng)元在介導(dǎo)鎮(zhèn)痛效果中起關(guān)鍵作用；而抑制這些脊髓神經(jīng)元可以完全消除RVM神經(jīng)元激活或嗎啡導(dǎo)致的鎮(zhèn)痛效果，表明RVM中的谷氨酸能神經(jīng)元在介導(dǎo)嗎啡鎮(zhèn)痛中起關(guān)鍵作用。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析也進(jìn)一步揭示這個(gè)結(jié)論，這些從RVM投射到脊髓的神經(jīng)元包括抑制性神經(jīng)元（GABAergic和serotonergic）以及少量的興奮性神經(jīng)元（glutamatergic），主要包含三種投射到脊髓的神經(jīng)元類(lèi)型：抑制性神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和少量的5-羥色胺能神經(jīng)元。其中，谷氨酸能GLUT2神經(jīng)元是RVM中對(duì)嗎啡最敏感的神經(jīng)元類(lèi)型，在介導(dǎo)鎮(zhèn)痛效果中起關(guān)鍵作用。而RVMBDNF神經(jīng)元便是主要屬于谷氨酸能神經(jīng)元類(lèi)型，RVMBDNF神經(jīng)元中的一部分會(huì)投射到脊髓，通過(guò)脊髓向大腦傳遞感覺(jué)信息通路，從而影響機(jī)械性疼痛的感知。當(dāng)使用化學(xué)遺傳學(xué)方法激活這些BDNF神經(jīng)元時(shí)，可以觀察到脊髓中Excitatory 20（Ex20）和Inhibitory 8（In8）神經(jīng)元的活性增加，表現(xiàn)為即時(shí)早基因（immediately early gene, IEG）表達(dá)的上調(diào)。這表明，RVMBDNF神經(jīng)元可以通過(guò)激活脊髓中特定的興奮性和抑制性神經(jīng)元來(lái)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

圖3 嗎啡引發(fā)的止痛作用是通過(guò)激活脊髓的興奮性RVM神經(jīng)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的

圖4 RVMBDNF神經(jīng)元介導(dǎo)的嗎啡抗疼痛作用依賴(lài)于BDNF/TrkB

最后研究人員利用FAST（fast analytical sensing technology）技術(shù)結(jié)合光遺傳學(xué)等方法，對(duì)神經(jīng)元谷氨酸釋放的動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了檢測(cè)。將光敏感離子通道蛋白o(hù)ChIEF（Cre-dependent ChR2 variant）表達(dá)在目標(biāo)神經(jīng)元上，并用用藍(lán)光刺激oChIEF表達(dá)的神經(jīng)元軸突末梢，誘發(fā)谷氨酸的釋放。然后在脊髓L4-L5區(qū)域植入微電極陣列，通過(guò)施加固定電位,可以檢測(cè)到谷氨酸被氧化產(chǎn)生的電流變化,從而測(cè)量谷氨酸的濃度變化。研究人員通過(guò)分析谷氨酸濃度的最大振幅和80%的衰減時(shí)間，用以評(píng)估神經(jīng)元活動(dòng)的動(dòng)力學(xué)特征。他們還通過(guò)數(shù)據(jù)分析，評(píng)估了不同神經(jīng)元亞群在基線和給藥條件下的活動(dòng)變化，從而探究了神經(jīng)元活動(dòng)與疼痛感知的關(guān)系。這種結(jié)合光遺傳學(xué)、電生理和生物信息學(xué)的多模態(tài)方法，為深入理解疼痛調(diào)控機(jī)制提供了新的研究思路。

圖5 嗎啡在脊髓中的止痛機(jī)理

在該項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)采用了多種實(shí)驗(yàn)手段，包括基因操控、行為學(xué)測(cè)試、病毒注射和組織學(xué)分析等，旨在從神經(jīng)元活動(dòng)的角度深入探究疼痛機(jī)制。首先，研究人員使用了多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括Arc-CreERT2、Vglut2-Cre和BDNF-2A-Cre小鼠，通過(guò)基因操控標(biāo)記和操控特定神經(jīng)元群體，同時(shí)使用Gal-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BL/6J野生型小鼠作為對(duì)照。為了評(píng)估小鼠對(duì)熱刺激和機(jī)械性刺激的反應(yīng)，研究人員采用了Hargreaves熱刺激實(shí)驗(yàn)、熱板實(shí)驗(yàn)和胡椒素注射實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)測(cè)試。此外，研究人員還進(jìn)行了病毒注射實(shí)驗(yàn)，包括腦內(nèi)注射、脊髓注射和靜脈注射，利用不同病毒載體（AAV、EnvA-pseudotyped等）轉(zhuǎn)染特定神經(jīng)元群體，以操控和標(biāo)記它們。為了檢測(cè)和定量特定蛋白（如Arc、NeuN）在腦區(qū)和脊髓中的表達(dá)情況，研究人員采用了免疫熒光染色和定量分析實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估神經(jīng)元的活性和分布。最后，研究人員利用FAST技術(shù)測(cè)量神經(jīng)元釋放谷氨酸的動(dòng)力學(xué)特征，以探究神經(jīng)元活動(dòng)與疼痛感知的關(guān)系；并采用免疫熒光染色和定量分析實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估神經(jīng)元的活性和分布。

熱板實(shí)驗(yàn)是一種常用于評(píng)估小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，小鼠被放置在一個(gè)正方形的透明塑料箱中，直接放在一個(gè)設(shè)定溫度為48°C的熱板上。實(shí)驗(yàn)人員會(huì)記錄小鼠在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)舔舐、咬咬、抖動(dòng)等逃避反應(yīng)的次數(shù)。這種熱刺激可以引起小鼠的疼痛感知反應(yīng)，從而評(píng)估其熱覺(jué)敏感性。除了熱板實(shí)驗(yàn)，研究人員還使用了Hargreaves熱刺激實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估小鼠的熱覺(jué)敏感性。研究團(tuán)隊(duì)利用Hargreaves熱刺激實(shí)驗(yàn)用以評(píng)估小鼠的熱覺(jué)敏感性。他們首先將小鼠放置在一個(gè)透明的塑料箱中，箱底為玻璃板，玻璃板下方放置一個(gè)輻射熱源，用于照射小鼠的后爪。實(shí)驗(yàn)人員記錄小鼠后爪出現(xiàn)逃避反應(yīng)的時(shí)間，每只小鼠刺激3次，間隔2分鐘。研究人員使用Arc-CreERT2小鼠用以捕獲對(duì)嗎啡和熱刺激反應(yīng)的神經(jīng)元，他們首先給小鼠皮下注射10 mg/kg的嗎啡，75分鐘后注射50 mg/kg的4-羥基他莫昔芬（4-OHT），以此尋找嗎啡激活的神經(jīng)元。為了捕獲熱刺激反應(yīng)的神經(jīng)元，研究人員使用Hargreaves裝置刺激小鼠的一只后爪，直到其出現(xiàn)逃避反應(yīng)，重復(fù)5次，每次間隔10分鐘，并在20分鐘后，小鼠也被注射50 mg/kg的4-OHT。通過(guò)熱板實(shí)驗(yàn)和Hargreaves實(shí)驗(yàn)，研究人員可以了解小鼠對(duì)熱刺激的行為反應(yīng)，為進(jìn)一步探究疼痛感知的神經(jīng)機(jī)制提供重要依據(jù)。這些行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法是神經(jīng)科學(xué)研究中常用的工具，有助于揭示疼痛調(diào)控的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。

結(jié)論與展望

研究發(fā)現(xiàn)，RVM區(qū)域存在一群特定的神經(jīng)元，它們對(duì)嗎啡的刺激能作出鎮(zhèn)痛反應(yīng)。通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，研究者鑒定出這些神經(jīng)元的分子特征，并發(fā)現(xiàn)其中部分興奮性神經(jīng)元表達(dá)BDNF。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，強(qiáng)制激活這些RVMBDNF神經(jīng)元可以模擬嗎啡誘導(dǎo)的機(jī)械性鎮(zhèn)痛效果，而抑制它們則可以完全逆轉(zhuǎn)這一效果。這些結(jié)果表明，RVMBDNF神經(jīng)元通過(guò)釋放BDNF，激活脊髓抑制性神經(jīng)元，從而調(diào)節(jié)機(jī)械性疼痛信號(hào)的傳遞,是嗎啡鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵神經(jīng)回路。此外，這項(xiàng)研究還采用了多種先進(jìn)的技術(shù)手段，如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、光遺傳學(xué)、快速電化學(xué)檢測(cè)等，為探索復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)功能提供了新的研究范式。例如，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析RVM區(qū)域的神經(jīng)元亞群，得以成功鑒定出調(diào)控機(jī)械性鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵神經(jīng)元群體。利用光遺傳學(xué)技術(shù)可以精準(zhǔn)地操控這些神經(jīng)元的活性，從而揭示其在嗎啡鎮(zhèn)痛中的作用。此外，快速電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)還能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)脊髓內(nèi)谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化，為理解神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控機(jī)制提供了新的研究手段。這些創(chuàng)新性的技術(shù)手段為神經(jīng)科學(xué)研究開(kāi)辟了新的可能性。

這一發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛機(jī)制的理解，也為開(kāi)發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供了新的靶點(diǎn)。通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控RVM-脊髓這一關(guān)鍵神經(jīng)回路，有望設(shè)計(jì)出新一代更加有效且安全的鎮(zhèn)痛藥物，減少嗎啡等傳統(tǒng)阿片類(lèi)藥物的副作用。