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13世紀，馬可波羅將水晶透鏡帶回歐洲，歐洲人因此學(xué)會了磨制鏡片的方法。當(dāng)時，發(fā)達的制造業(yè)令玻璃成為一種廉價的材料，佛羅倫薩的能工巧匠利用玻璃制作出了第一只眼鏡，從此，眼鏡制造業(yè)橫空出現(xiàn)并且紅紅火火地發(fā)展起來。然而第一批使用眼鏡的歐洲人，多是年紀大且老花眼的老年人，他們需要的是可以令他們看清眼前事物的老花鏡，也就是凸透鏡。早期的眼鏡，來源：wikipedia

人們很快發(fā)現(xiàn)，凸透鏡可以令物體的影像放大。于是，一些好奇的人們開始使用它來觀察微小物體。但是這種放大鏡的放大倍數(shù)也就是讓孩子們近距離看看昆蟲而已，想要觀察更加細微的東西，就只能尋求別的工具。

16世紀90年代，一位十歲左右的孩子扎卡萊亞斯·詹森（Zacharias Janssen），跟隨父親漢斯·詹森（Hans Janssen）在街頭販賣自家打磨出來的鏡片。或許是年幼的他在工作間觀看父親制作工序時產(chǎn)生了靈感，他將多塊凸透鏡組合在一起，就是這小小的靈感而引發(fā)的舉動，引導(dǎo)了人類看向了微觀世界。

在父親漢斯的幫助下，小詹森制作出了第一臺顯微鏡，這是一個構(gòu)造非常簡單的顯微鏡：它由三個鏡筒連接而成，中間那個鏡筒比較粗，適于手握；另外兩個鏡筒則分別插進它的兩端，它們可以伸縮調(diào)整，以達到聚焦的目的。當(dāng)這個顯微鏡兩個活動的鏡筒完全收攏時，它的放大倍數(shù)是3倍；當(dāng)它們完全伸展開時，放大倍數(shù)就有10倍。

詹森復(fù)式顯微鏡，1841年制的復(fù)刻版,來源：wikipedia

不過很可惜，詹森父子倆的這個顯微鏡雖然打開了探索微觀世界的大門，但卻沒能讓人們真真正正踏入其中。在那個認知水平有限的年代，人們僅樂于拿它觀看跳蚤和其他小昆蟲，因此這只顯微鏡又被稱作“跳蚤鏡”。

1654年，22歲的列文·虎克（Antonie van Leeuwenhoek）結(jié)束了在阿姆斯特丹布店學(xué)徒的日子，回到家鄉(xiāng)代爾夫，開了一家屬于自己的小布店。

早期，他嘗試著用凸透鏡的放大作用來鑒定布料的質(zhì)量。初始的布料店并不算忙碌，他在閑暇之余，很快就培養(yǎng)起了對凸透鏡的興趣，并嘗試自己打磨鏡片。列文·虎克這個沒上過幾年學(xué)的年輕人，靠著興趣竟在小店中制造出了世界一流的鏡片。鏡片厚度僅為1毫米，曲率半徑為0.75毫米，有著很高的放大率和分辨率。

在掌握了這項技術(shù)后，列文·虎克將透鏡鑲嵌在兩塊鑿出小孔的黃銅片之間，用螺絲連接在一個金屬固定器上。螺釘可以用于調(diào)節(jié)標本與透鏡之間的距離，以調(diào)整焦距。就此，人類歷史上第一臺真正意義上的顯微鏡誕生了，這臺顯微鏡放大倍數(shù)可達720倍，要知道，當(dāng)時其他可以稱得上是顯微鏡的鏡片，放大倍數(shù)最高也只有50倍。

列文虎克在17世紀設(shè)計的顯微鏡圖，來源：wikipedia

列文·虎克對微觀世界的興趣日益濃厚，帶著他獨創(chuàng)的顯微鏡開始進入科學(xué)領(lǐng)域，看到了他人從未看到的東西。在顯微鏡下，他觀測到了池塘水中的原生動物，鮭魚血液中的紅細胞；他還在牙垢里發(fā)現(xiàn)了細菌，并將結(jié)果寫成報告寄給英國皇家學(xué)會，獲得了后者的肯定，從而開創(chuàng)了微生物學(xué)。

他在微觀世界里遨游，不斷發(fā)現(xiàn)著各種各樣令人震驚的事實，從而改變?nèi)藗儗ρ矍皩こＪ挛锏墓逃姓J知。

為了提高單鏡片顯微鏡的觀測能力，就必須要縮短焦距。縮短焦距必須要縮短鏡片的直徑。變小的鏡片，很容易磨損，經(jīng)過一段時間的反復(fù)使用，鏡片變得模糊很難看清。

為解決這個問題，17世紀左右，英國皇家學(xué)會負責(zé)科學(xué)試驗的科學(xué)家羅伯特·虎克（Robert Hooke）制作了一臺復(fù)式顯微鏡，與列文·虎克使用的單透鏡顯微鏡不同，這種顯微鏡使用了不止一個鏡片，一個鏡片下的圖像可以接著被另一個鏡片放大。復(fù)式顯微鏡里，緊貼物體的鏡片叫“物鏡”，緊貼眼睛的叫“目鏡”。從本質(zhì)來說，其工作原理和外形已經(jīng)很接近現(xiàn)代的光學(xué)顯微鏡了。

羅伯特虎克使用的復(fù)式顯微鏡，來源：wikipedia

可即便是很接近現(xiàn)代的光學(xué)顯微鏡，卻依然存在著難以突破的問題——色差，就是在光線經(jīng)過透鏡時，不同顏色的光因折射率不同，會聚焦于不同的點上，使得觀察物的成像被一層色彩光斑所包圍，嚴重影響清晰度。

而且早期玻璃質(zhì)量不高，顯微鏡還存在著球面像差的問題，即光線在經(jīng)過透鏡折射時，接近中心與靠近邊緣的光線不能將影像聚集在一點上，也會使得成像模糊不清。

自顯微鏡誕生之日起，色差和球面像差就成為“與生俱來的頑疾”，一直阻礙著人們向微觀世界進軍的步伐。

直到19世紀，光學(xué)顯微技術(shù)才在工業(yè)革命的助力下完成了一次實質(zhì)性蛻變，在根本上解決了這兩個難題。

1830年，一位英國業(yè)余顯微鏡學(xué)愛好者約瑟夫·杰克遜·李斯特（Joseph Jackson Lister)對顯微鏡的球面像差發(fā)起了挑戰(zhàn)，他創(chuàng)造性地用幾個特定間距的透鏡組，成功減小了球面像差影響。

1846年，德國蔡司光學(xué)工廠成立，1857年蔡司工廠研制出第一臺現(xiàn)代復(fù)式顯微鏡。在研制和生產(chǎn)過程中，蔡司也難以抗衡色差問題。直到1872年，德國耶拿大學(xué)的恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）教授提出了完善的顯微鏡學(xué)理論，詳細闡述了光學(xué)顯微鏡的成像原理、數(shù)值孔徑等科學(xué)問題。蔡司即刻邀請阿貝教授加盟，他們共同開發(fā)出一款劃時代的光學(xué)部件——復(fù)消色差透鏡，一舉消除了色差的影響。

1862年蔡司生產(chǎn)的現(xiàn)代復(fù)式顯微鏡，來源：wikipedia

蔡司奠定了現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡的基本形態(tài)，顯微鏡的設(shè)計已全然建立在健全的物理定律上，而不再是先驅(qū)者的反復(fù)試驗。顯微鏡技術(shù)的突飛猛進也促使各種現(xiàn)代生物學(xué)理論的不斷提升，透過高分辨率的透鏡，微觀世界中各種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)逐步以具象的形式呈現(xiàn)在人類眼前。

在這一時期，微生物學(xué)家通過給生物樣品染色，來方便肉眼觀察。這一方法的局限在于染色劑本身的毒性會破壞微生物組織結(jié)構(gòu)，直到1930年，荷蘭科學(xué)家澤尼克(Frederik Zernike)提出了相襯法，即通過空間濾波器將物體的相位信息轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的振幅信息，從而大大提高透明物體的可分辨性。1941年，蔡司將相襯法應(yīng)用于顯微鏡中，由此相差顯微鏡誕生。

二戰(zhàn)結(jié)束后，光學(xué)顯微鏡已得到了長足的進步，其潛力被挖掘到極致，蔡司工廠以及阿貝教授均認為無法再一次提升微觀世界的清晰度。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限在0.2微米，能夠看到細菌和細胞，再小的物體也就無能為力了，這一理論被稱為“阿貝極限”。

即便是在幾乎觸達光學(xué)顯微鏡“天花板”的狀態(tài)下，不少科學(xué)家們?nèi)匀幌Ｍ梢越忾_“阿貝極限”的枷鎖，而“熒光技術(shù)”就成為了那把鑰匙。

科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，某些物質(zhì)在吸收波長較短而能量較高的光線，如紫外線時，能將光源轉(zhuǎn)化為波長較長的可見光，這種現(xiàn)象被定義為“熒光現(xiàn)象”。

1911年，德國科學(xué)家首次研制出熒光顯微鏡裝置，用熒光色素對被觀測樣品進行熒光染色處理，并以紫外光激發(fā)樣品的熒光物質(zhì)發(fā)光，但成像效果不佳，而且把熒光物質(zhì)當(dāng)作染色劑，和早期的染色劑一樣，本身的毒性會傷害活體樣品。

熒光顯微鏡示意圖，來源：wikipedia

直到1974年，日本科學(xué)家下村修發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白，其毒性遠弱于以往的熒光物質(zhì)，是對活體標本進行熒光標記的理想材料。

1989年，科學(xué)家威廉姆·艾斯科·莫爾納爾（William Esco Moerner）提出了一種方法，巧妙繞開了大自然對可見光的限制，通過提升觀測物的可見程度來實現(xiàn)突破分辨率0.2微米的極限。

他首次進行了單分子熒光檢測，工作原理類似于日光燈中的熒光粉，用特定波長的光去激發(fā)熒光粉，它們就會發(fā)射出相應(yīng)的熒光。這一巧妙地發(fā)現(xiàn)，讓光學(xué)顯微鏡的檢測尺度精確到納米量級成為可能。隨后在此基礎(chǔ)上，美國科學(xué)家羅伯特·埃里克·貝齊格（Robert Eric Betzig）開發(fā)出一套新的顯微成像方法：控制觀測物的熒光分子，讓少量分子發(fā)光，只要每兩個分子之間的距離大于0.2微米，光學(xué)顯微鏡就可以清晰地觀測到。通過對同一區(qū)域反復(fù)成像，最后用軟件重現(xiàn)所有的閃光點，科學(xué)家就得到了納米尺度的稠密、精確圖像。通過這種方法，貝齊格輕而易舉地突破了光學(xué)顯微鏡的“阿貝極限”。

熒光顯微鏡下的細胞，來源：wikipedia可見光存在著“阿貝極限”，那么如果利用波長較短的光束是否也能突破分辨率的桎梏呢？

1931年，德國科學(xué)家諾爾（Max Knoll）和他的學(xué)生魯斯卡（Ernst Ruska）在一臺高壓示波器上加入了一個放電電子源和三個電子透鏡，制成了世界上首臺電子顯微鏡。

首臺電子顯微鏡，來源：wikipedia

電子顯微鏡，是利用電子束轟擊固體樣品，在其表面或內(nèi)部發(fā)生散射時，各種散射信號被相應(yīng)探測器采集后，可直接或間接體現(xiàn)固體樣品在微觀區(qū)域獨特的物理化學(xué)信息。電子顯微鏡完全不受“阿貝極限”的約束，在分辨率上遠遠超越了光學(xué)顯微鏡，達到納米級別（1微米=1000納米），在這個觀測尺度下，人類看到了比細菌更小的微生物——病毒。

電子顯微鏡是人類認識超微觀世界的途徑，從肉眼可見的毫米尺度，到光學(xué)顯微鏡可達的微米尺度，再到電子顯微鏡下的納米尺度，顯微成像技術(shù)正在迅速突破人類對微觀世界的認知極限。

電子顯微鏡所具備的超高分辨率是光學(xué)顯微鏡無法企及的高度，但是電子顯微鏡的缺憾也漸漸顯露出來。電子加速只可以在真空條件下實現(xiàn)，然而，處于真空環(huán)境下的生物，往往要經(jīng)過脫水和干燥，這意味著電子顯微鏡下沒有活體狀態(tài)的生物樣本，并且電子束本身也容易破壞樣品表面的生物分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致一些關(guān)鍵信息無法被生物學(xué)家們順利捕捉到。

橫跨五十年，直到1981年，在蘇黎世的IBM實驗室中，科學(xué)家蓋爾德·賓尼（Gerd Bining）和海因里?！ち_雷爾（Heinrich Rohrer）采用了一些看似離經(jīng)叛道的方法，改變了電子顯微鏡損傷樣品結(jié)構(gòu)的問題。他們利用量子物理學(xué)中的“隧道效應(yīng)”，制作了一臺掃描隧道顯微鏡。

掃描隧道顯微鏡，來源：wikipedia

與傳統(tǒng)的光學(xué)和電子顯微鏡不同，這種顯微鏡連鏡頭都沒有。在工作時，用一根探針接近觀測物，并在兩者之間施加電壓，當(dāng)探針距離樣品只有納米級時就會產(chǎn)生隧道效應(yīng)——電子從這細微的縫隙中穿過，形成微弱的電流，這股電流會隨著探針與樣品距離的變化而變化，通過測量電流的變化人們就能間接得到觀測物的大致形狀。由于全程沒有電子束參與，掃描隧道顯微鏡從根本上避免了加速電子對生物樣品表面的破壞。

隨后幾年，蓋爾德·賓尼（Gerd Bining）又與C.FQuate和C.Gerber等人，研制成功了原子力顯微鏡，原子力顯微鏡利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細探針與受測樣品原子之間的作用力，從而達到檢測的目的，具有原子級的分辨率。由于原子力顯微鏡既可以觀察導(dǎo)體，也可以觀察非導(dǎo)體，從而彌補了掃描隧道顯微鏡的不足，極大拓寬了人類對于生物、化學(xué)、材料、物理等領(lǐng)域的認知疆界。目前，電子顯微鏡已經(jīng)成為金屬、半導(dǎo)體和超導(dǎo)體領(lǐng)域的主力軍。

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，科學(xué)家們?nèi)匀辉趯ふ夷軌驑O大程度避免電子束損害生物樣品的辦法，他們從另一個角度出發(fā)，在不改變電子顯微鏡整體工作模式的情況下，去改變觀測物本身，對其進行超低溫冷凍處理，研發(fā)冷凍電鏡技術(shù)。由于觀測溫度低，生物樣品也處于含水狀態(tài)，分子也處于天然狀態(tài)，樣品對輻射的耐受能力得以提高。

利用這項技術(shù)，科學(xué)家們可以將樣品凍結(jié)在不同的狀態(tài)，觀測分子結(jié)構(gòu)的變化。在新冠疫情爆發(fā)后，冷凍電鏡技術(shù)為人類研究和抗擊疫情做出了突出貢獻。

2020年，我國的科學(xué)團隊周強實驗室就在BioRxiv上發(fā)表了新冠病毒的受體—ACE2的全長結(jié)構(gòu)，利用的就是冷凍電鏡技術(shù)來成像，這讓人類對新冠病毒的認識又向前邁進了一步。

冷凍電鏡技術(shù)成像，來源：百度冷凍電鏡技術(shù)成像動態(tài)圖，來源：百度

時至今日，人類對微觀世界的探究從未停止，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡互補互足、相得益彰。未來，更加廣闊的和更加多元化的顯微成像技術(shù)，將會進一步完善我們生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、物理等各個領(lǐng)域的知識結(jié)構(gòu)，將包羅萬象的世界展現(xiàn)在我們的眼前。

這復(fù)雜而長久的探索旅程，使我們明白：看見不可見，不只是一種想象。

Reference:

https://baijiahao.baidu.com/s?id=1680812072031746312&wfr=spider&for=pc

http://zhishifenzi.com/depth/newsview/1891

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https://chanzuckerberg.com/blog/the-past-present-and-future-of-medical-imaging/

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https://baike.baidu.com/item/%E6%B3%BD%E5%B0%BC%E5%85%8B/10942480?fr=aladdin

https://www.microscope.com/education-center/microscopes-101/history-of-microscopes

https://ceramics.org/ceramic-tech-today/video-scanning-tunneling-microscope-gets-upgrade-that-could-enable-atomic-scale-fabrication

https://zj.zjol.com.cn/news.html?id=594912

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