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生命科學(xué)Life science

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Cell Press細(xì)胞出版社微信公眾號(hào)對該論文進(jìn)行了解讀，旨在與廣大科研人員深入分享該研究成果以及一些未來的展望。點(diǎn)擊“閱讀原文”或識(shí)別下圖二維碼閱讀英文原文最新在中心上線的發(fā)表在Cell Press細(xì)胞出版社旗下期刊Cell上的研究，名為” Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy”。來自Gladstone 研究所的科研人員發(fā)明了一種免擴(kuò)增的CRISPR-Cas13a檢測技術(shù)，該技術(shù)可從鼻拭子RNA中直接檢測SARS-CoV-2，并且可以通過手機(jī)顯微鏡對其進(jìn)行讀取。該檢測方法有可能實(shí)現(xiàn)針對SARS-CoV-2的低成本快速即時(shí)篩查。

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摘要

2019年12月暴發(fā)的新型呼吸道病毒SARS-CoV-2現(xiàn)已發(fā)展為全球大流行，部分原因是確定感染該病毒的有癥狀患者、無癥狀攜帶者和有前驅(qū)癥狀的攜帶者十分困難。如果CRISPR診斷程序可以快速、便攜和準(zhǔn)確地進(jìn)行，那就可以增強(qiáng)基于PCR的金標(biāo)準(zhǔn)診斷測試。在此，我們報(bào)告了一種免擴(kuò)增的CRISPR-Cas13a檢測技術(shù)，該技術(shù)可從鼻拭子RNA中直接檢測SARS-CoV-2，并且可以通過手機(jī)顯微鏡對其進(jìn)行讀取。該測定法在30分鐘的測量時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到約100拷貝/μL的靈敏度，并且能在5分鐘內(nèi)從一組陽性臨床樣品中準(zhǔn)確地檢測出預(yù)提取的RNA。我們結(jié)合了靶向SARS-CoV-2 RNA的crRNA來提高這一檢測方法的敏感性和特異性，并利用酶動(dòng)力學(xué)直接量化了病毒載量。結(jié)合手機(jī)讀取設(shè)備，該檢測方法有可能實(shí)現(xiàn)針對SARS-CoV-2的低成本快速即時(shí)篩查。

簡介

目前，SARS-CoV-2感染的金標(biāo)準(zhǔn)診斷方法是定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR），這也是一種廣泛應(yīng)用于篩查的成熟檢測手段?；卺槍艘職ぃ∟）蛋白、包膜（E）蛋白和開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因的引物，RT-qPCR的分析檢測限度（LOD）為1,000病毒RNA拷貝/ mL，即1拷貝/μL（Vogels et al., 2020）。然而，最新的病毒動(dòng)力學(xué)模型表明，為了控制當(dāng)前的大流行，我們需要一種能夠快速周轉(zhuǎn)的高頻檢測手段（Larremore et al., 2020）。值得注意的是，該模型將檢測的敏感性列為較低優(yōu)先級(jí)，估計(jì)100,000拷貝/ mL（100拷貝/μL）的LOD就足以達(dá)到篩查水平（Larremore et al., 2020）。盡管研究人員對于所需的準(zhǔn)確目標(biāo)LOD尚未達(dá)成廣泛共識(shí)，但高頻檢測和快速周轉(zhuǎn)有助于減少病毒傳播，即使檢測的敏感性不高。在臨床研究中，當(dāng)病毒載量在1,000,000百萬拷貝/ mL（1,000拷貝/μL）以下時(shí)，傳染性顆粒幾乎不能檢測到，因此病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)很低（La Scola et al., 2020; Quicke et al., 2020; Wolfel et al., 2020）。

人們亟需一種能夠識(shí)別傳染性個(gè)體且快速而廣泛的SARS-CoV-2檢測，這一需求促使人們致力于探索基于CRISPR技術(shù)的病毒RNA檢測新策略。Cas12和Cas13蛋白是細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)成分，它們分別直接靶向單鏈、雙鏈DNA或單鏈（ss）RNA底物（Abudayyeh et al., 2016; Chen et al., 2018; East-Seletsky et al., 2016; Zetsche et al., 2015）。Cas13與含有可編碼間隔序列的CRISPR RNA（crRNA）結(jié)合，形成了一種不激活核酸酶的核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）。當(dāng)RNP與互補(bǔ)的目標(biāo)RNA結(jié)合時(shí)，它能激活Cas13的HEPN基序（高級(jí)真核生物和原核生物的核苷酸結(jié)合區(qū)域），然后不加選擇地切割周圍的任何ssRNA。RNP與目標(biāo)RNA的結(jié)合和隨后的Cas13裂解活性可通過與ssRNA連接的熒光猝滅劑進(jìn)行檢測，ssRNA在激活Cas13裂解后會(huì)發(fā)出熒光（East-Seletsky et al., 2016）。

使用細(xì)菌誘導(dǎo)細(xì)胞休眠以減少噬菌體傳播的成功策略（Meeske et al., 2019）現(xiàn)已廣泛用于病毒診斷（Chen et al., 2018; East-Seletsky et al., 2016; Gootenberg et al., 2018; Gootenberg et al., 2017; Myhrvold et al., 2018）。為了實(shí)現(xiàn)檢測的高靈敏度，目前的CRISPR診斷法（CRISPR Dx）依賴于目標(biāo)RNA的預(yù)擴(kuò)增，以便用于隨后的Cas蛋白檢測。對于RNA敏感的Cas13蛋白，人們需要通過一系列復(fù)雜的方法才能對Cas13a或Cas13b進(jìn)行檢測，這種方法被稱為“SHERLOCK”法（Gootenberg et al., 2018; Gootenberg et al., 2017）。該方法最近被用于SARS-CoV-2的檢測（Joung et al., 2020b），并進(jìn)一步發(fā)展為用于檢測未提取樣品的“SHINE”法（Arizti-Sanz et al., 2020）。通過使用DNA敏感的Cas12進(jìn)行檢測，可以避免將擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)換回RNA，這種方法稱為“DETECTR”法（Chen et al., 2018），最近已用于SARS-CoV-2的檢測（Broughton et al., 2020）。SHERLOCK和DETECTR法可以使用適用于即時(shí)檢測的紙質(zhì)側(cè)向流動(dòng)條進(jìn)行讀取，但都需要大約一個(gè)小時(shí)才能完成，而且目前FDA批準(zhǔn)的檢測方法仍然是基于實(shí)驗(yàn)室的。

在此，我們報(bào)道了一種基于CRISPR-Cas13a的快速檢測方法并進(jìn)行了演示，這種方法可直接檢測SARS-CoV-2 RNA。與既往的CRISPR診斷不同，這種方法不需要預(yù)先擴(kuò)增病毒基因組即可進(jìn)行檢測。無需進(jìn)行其他操作，該方法就可以進(jìn)行定量RNA測量，而不是僅僅得出簡單的陽性或陰性結(jié)果。為了證明該測定法的簡便性和便攜性，我們使用小型精簡設(shè)備的手機(jī)攝像頭進(jìn)行了熒光測試，這種設(shè)備使用了低成本的激光照明和光學(xué)采集器件。因?yàn)槭謾C(jī)攝像頭具有高靈敏度和強(qiáng)連接性，以及GPS和數(shù)據(jù)處理功能，所以這是一種可以應(yīng)用到資源匱乏地區(qū)的有益工具，有助于即時(shí)地診斷疾?。˙reslauer et al., 2009; D'Ambrosio et al., 2015; Kamgno et al., 2017; Wood et al., 2019）。通過組合多個(gè)crRNA來增強(qiáng)Cas13a的活化并分析熒光隨時(shí)間的變化（而不是只分析終點(diǎn)熒光），我們能夠使用該設(shè)備在30分鐘的測量時(shí)間內(nèi)檢測到約100拷貝/μL的預(yù)提取SARS-CoV-2 RNA。我們還可以使用該設(shè)備在5分鐘內(nèi)正確識(shí)別出所有用于測試的SARS-CoV-2陽性患者的RNA樣品（Ct值14.37~22.13）。這種方法或可為即時(shí)SARS-CoV-2篩查提供快速、準(zhǔn)確、便攜的低成本選項(xiàng)。

結(jié)果

用Cas13a直接檢測并量化新冠病毒RNA

當(dāng)SARS-CoV-2序列于2020年1月公開時(shí)，我們著手開發(fā)了一種基于Cas13的病毒RNA直接檢測方法，該測定法無需擴(kuò)增病毒RNA即可進(jìn)行即時(shí)檢測。為此，我們需要通過仔細(xì)選擇合適的crRNA來優(yōu)化Cas13的激活，并為我們的測定方法開發(fā)靈敏度高且便攜的熒光檢測系統(tǒng)（圖1A）。最初，我們根據(jù)SARS-CoV-2的N蛋白基因設(shè)計(jì)了12個(gè)crRNA（表S1）。每個(gè)Cas13-crRNA RNP都能檢測到N蛋白基因中單個(gè)長20個(gè)核苷酸的區(qū)域（圖1B）。

在480 fM（2.89 x 105拷貝/微升）的目標(biāo)RNA濃度下，我們鑒定出了10個(gè)具有活性的crRNA。我們在平板讀取器上通過直接檢測測定法分別測試了每個(gè)crRNA，最終選擇了兩個(gè)crRNA（crRNA 2和4）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，因?yàn)樗鼈儗as13a活化的作用最大。

接下來，我們對目標(biāo)RNA進(jìn)行了稀釋，以分別確定每種crRNA的檢測限度。LbuCas13a在低至10 fM（約6000拷貝/μL）的目標(biāo)RNA水平上顯示出了可探測到的報(bào)告基因裂解，（East-Seletsky et al., 2017）。針對SHERLOCK法的研究曾報(bào)道，未進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增的檢測限度為約50 fM（Gootenberg et al., 2017）。與此相符的是，我們發(fā)現(xiàn)，對于1,000拷貝/μL的體外轉(zhuǎn)錄（IVT）目標(biāo)RNA濃度，使用crRNA 2和crRNA 4制成的RNP似乎不會(huì)產(chǎn)生高于RNP對照的熒光信號(hào)（圖1D）。通過Cas13a直接檢測產(chǎn)生的信號(hào)似乎與測定中目標(biāo)RNA的濃度成正比。結(jié)果證實(shí)，crRNA 2和4均促進(jìn)了至少10,000拷貝/μL的IVT N基因RNA探測（圖1E）。另外，我們證實(shí)了Cas13a激活的速率與目標(biāo)RNA的濃度成比例（圖S1B-D）。

組合crRNA可提高Cas13a的敏感性

接下來，我們在同一反應(yīng)中組合了crRNA，從而形成兩個(gè)不同的RNP亞群，然后我們評估這種方式能否增強(qiáng)Cas13a的整體活化，從而提高測定的靈敏度。研究發(fā)現(xiàn)，crRNA 2和4的結(jié)合顯著增加了檢測反應(yīng)的斜率和反應(yīng)的敏感性（圖2B）。為了確定crRNA組合如何影響檢測限度，我們使用了經(jīng)過稀釋的一系列IVT N蛋白基因RNA對crRNA 2 + 4進(jìn)行了測試。與無靶標(biāo)的RNP對照（RNP 2 + 4）相比，crRNA 2 + 4與RNP的組合將檢測限提高到至少100拷貝/μL IVT目標(biāo)RNA（圖2C）。我們從SARS-CoV-2感染的Vero CCL-81細(xì)胞上清液中分離了病毒RNA并對其進(jìn)行了相同的測定，發(fā)現(xiàn)該測定法可以檢測到至少270病毒拷貝/μL的RNA（圖2D）。

CRISPR診斷的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它們的高度特異性。為了確認(rèn)我們的crRNA的特異性，我們使用了一組不同于新冠病毒的呼吸道病毒進(jìn)行了測試，包括α冠狀病毒HCoV-NL63、β冠狀病毒HCoV-OC43，以及中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。我們將crRNA 2和4單獨(dú)或組合使用于Cas13a直接檢測分析時(shí)，對于任何測試的病毒RNA，我們都未檢測到高于背景RNP的信號(hào)（圖3A）。

討論

在此，我們展示了使用CRISPR-Cas13a和手機(jī)直接檢測SARS-CoV-2 RNA的方法，為快速即時(shí)檢測提供了一種頗有前景的選項(xiàng)。本研究取得的第一個(gè)關(guān)鍵進(jìn)展是證明了crRNA組合可以通過激活更多的Cas13a（以每個(gè)目標(biāo)RNA計(jì)）來提高檢測的敏感性。我們的研究表明，兩個(gè)或三個(gè)crRNA的組合可用于探測低至約30拷貝/μL的目標(biāo)病毒RNA。充分利用靶向基因組不同部分的各種crRNA也可以避免由于自然發(fā)生的病毒突變而導(dǎo)致的不完全檢測。

本研究取得的第二個(gè)關(guān)鍵進(jìn)展是將熒光信號(hào)直接轉(zhuǎn)化為病毒載量的量化。我們設(shè)計(jì)的方法無需對病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增，而是采用直接探測的方法。在這一過程中，我們顯示了反應(yīng)速率與病毒拷貝數(shù)直接相關(guān)，因而可用于定量分析。結(jié)合高頻檢測，定量數(shù)據(jù)可能會(huì)帶來許多益處：可以監(jiān)測患者感染的病程，確定感染是在增強(qiáng)還是減弱。既往研究提出，有癥狀感染者中，病毒載量隨感染病程的變化而變化（Wolfel et al., 2020）。定量監(jiān)測病毒載量可以估計(jì)患者的感染階段，且有助于實(shí)時(shí)預(yù)測患者的感染力、恢復(fù)力和解除隔離的恰當(dāng)時(shí)機(jī)。

本項(xiàng)工作的第三個(gè)關(guān)鍵進(jìn)展是開發(fā)了基于移動(dòng)電話和低成本光學(xué)器件的小型顯微鏡，可用于準(zhǔn)確讀取Cas13a直接檢測的分析結(jié)果，在30分鐘內(nèi)可實(shí)現(xiàn)約100拷貝/μL的靈敏度；而且，該設(shè)備可以在5分鐘內(nèi)準(zhǔn)確診斷從患者樣品中預(yù)先提取的一組RNA。這表明可以構(gòu)建基于消費(fèi)電子產(chǎn)品而非專業(yè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的便攜式診斷設(shè)備，并與Cas13a分析一起使用。結(jié)合對密切接觸者的有效跟蹤以及上傳至云系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，移動(dòng)便攜式SARS-CoV-2診斷程序可以在當(dāng)前和未來的大流行中發(fā)揮重要作用。

雖然我們證明了使用基于現(xiàn)有PCR引物的crRNA可以實(shí)現(xiàn)靈敏度較高的快速檢測，但我們也希望能系統(tǒng)地搜索整個(gè)病毒RNA基因組中最佳的crRNA組合，從而進(jìn)一步改善該檢測手段。隨著研究者發(fā)現(xiàn)了更多有關(guān)病毒變體的信息（Osorio and Correia-Neves, 2020; Vanaerschot et al., 2020），人們可以調(diào)整crRNA設(shè)計(jì)，從而避免假陰性結(jié)果。不過，組合crRNA在提高靈敏度的同時(shí)也導(dǎo)致意外脫靶的幾率升高了。而且，當(dāng)組合中的一種crRNA與樣品中的病毒序列不完全匹配時(shí)，只有較低的病毒載量得到了記錄。未來的研究有望進(jìn)一步改進(jìn)報(bào)告基因、Cas13蛋白的選擇，以及探測裝置和攝像頭的感光度。這些進(jìn)展或許能提高反應(yīng)速率，從而可以在較短的時(shí)間內(nèi)提高檢測的精度和檢測限度。

最近一項(xiàng)針對超過19,000多名受訪者的全國調(diào)查顯示，基于鼻拭子的qPCR測試結(jié)果的平均等待時(shí)間為4.1天，其中31％的檢測耗費(fèi)4天以上，而10％的測試耗費(fèi)10天或更長時(shí)間（Lazer et al., 2020）。處理這些實(shí)驗(yàn)室檢測的國家積壓工作清楚地突出了我們對快速即時(shí)檢測的需求。由于自然感染或疫苗接種產(chǎn)生的長期免疫力可能會(huì)在2-4個(gè)月內(nèi)下降（Ibarrondo et al., 2020; Long et al., 2020），因此對新冠病毒的快速高頻檢測需求可能會(huì)持續(xù)存在。在未來，我們在此提出的Cas13a直接檢測方法可以迅速進(jìn)行調(diào)整，服務(wù)于下一種可能暴發(fā)的呼吸道病原體檢測，希望能夠及時(shí)遏制傳染性疾病在全球范圍內(nèi)的擴(kuò)散。相關(guān)論文信息

原文刊載于CellPress細(xì)胞出版社旗下期刊Cell上

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▌?wù)撐臉?biāo)題：

Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy

▌?wù)撐木W(wǎng)址：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31623-8#figures

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001

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